T4 DNA聚合酶对5´→3´方向的DNA合成起到催化作用，需要使用模板和引物。该酶具有3´→5´核酸外切酶活性，比DNA聚合酶I（E. coli）中发现的活性高得多。与DNA聚合酶I（E. coli）不同，T4 DNA聚合酶不具有5´→3´核酸外切酶功能。

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